Cinética enzimática de la polifenol oxidasa.

INTRODUCCIÓN

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad puede determinarse midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos. Siguiendo esa velocidad en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción (cinética de la reacción). La medida de la velocidad de la reacción se realiza en condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc., y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato, para que la velocidad observada sea la máxima. 

A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción. Por esta razón se mide la velocidad inicial de la reacción (que es igual a la pendiente de la curva); y así puede considerarse la concentración del sustrato como constante.

En 1913  Michaelis y Menten propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas:

Propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas. En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre. En la ecuación k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso, que también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad.

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (Vo frente a [S]o) es una hipérbola. La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

OBJETIVO

 Ejemplificar cómo se determina la V_o de una enzima y el método para analizar la relación entre la  [S] y la  V_o, lo que nos permitirá calcular la Km y la V_max.

MATERIAL 

PROCEDIMIENTO 

RESULTADOS

Tubo 1 DOPA 0 mg

Tiempo (seg)	Absorbancia (475 nm)
0	0
10	0
20	0
30	0
40	0
50	0
60	0
70	0
80	0
90	0
100	0
110	0
120	0
130	0
140	0
150	0
160	0
170	0
180	0
190	0
200	0
210	0
220	0
230	0
240	0
250	0
260	0
270	0
280	0
290	0
300	0

Tubo 2 DOPA 1.034mg/ml

Tiempo (seg)	Absorbancia (475 nm)
0	0
10	0
20	0
30	0
40	0
50	0
60	0
70	0
80	0
90	0
100	0
110	0,005
120	0,005
130	0,005
140	0,008
150	0,009
160	0,009
170	0,009
180	0,01
190	0,01
200	0,01
210	0,01
220	0,011
230	0,011
240	0,011
250	0,011
260	0,012
270	0,013
280	0,013
290	0,013
300	0,013

Tubo 3 DOPA  2.069mg/ml

Tiempo (seg)	Absorbancia (475 nm)
0	0
10	0
20	0,001
30	0,003
40	0,004
50	0,005
60	0,005
70	0,006
80	0,008
90	0,008
100	0,008
110	0,009
120	0,01
130	0,01
140	0,012
150	0,012
160	0,013
170	0,013
180	0,014
190	0,014
200	0,015
210	0,015
220	0,015
230	0,015
240	0,015
250	0,015
260	0,015
270	0,015
280	0,015
290	0,015
300	0,015

Tubo 4 DOPA 4.139 mg/ml

Tiempo (seg)	Absorbancia (475 nm)
0	0
10	0
20	0,002
30	0,004
40	0,006
50	0,008
60	0,009
70	0,01
80	0,01
90	0,011
100	0,013
110	0,014
120	0,015
130	0,015
140	0,016
150	0,017
160	0,018
170	0,018
180	0,018
190	0,019
200	0,019
210	0,019
220	0,02
230	0,02
240	0,02
250	0,02
260	0,021
270	0,021
280	0,022
290	0,022
300	0,022

Tubo 5 DOPA 5.174mg/ml

Tiempo (seg)	Absorbancia (475 nm)
0	0
10	0,004
20	0,006
30	0,008
40	0,009
50	0,011
60	0,013
70	0,015
80	0,016
90	0,017
100	0,018
110	0,019
120	0,02
130	0,02
140	0,021
150	0,022
160	0,022
170	0,022
180	0,024
190	0,024
200	0,025
210	0,025
220	0,026
230	0,026
240	0,026
250	0,026
260	0,027
270	0,027
280	0,027
290	0,027
300	0,027

Tubo 6 DOPA 6.209mg/ml

Tiempo (seg)	Absorbancia (475 nm)
0	0
10	0,003
20	0,005
30	0,008
40	0,009
50	0,011
60	0,014
70	0,015
80	0,016
90	0,017
100	0,018
110	0,019
120	0,019
130	0,02
140	0,021
150	0,022
160	0,023
170	0,024
180	0,024
190	0,024
200	0,025
210	0,025
220	0,025
230	0,025
240	0,025
250	0,025
260	0,025
270	0,025
280	0,025
290	0,025
300	0,026

CÁLCULOS

 Graficar la absorbancia en función del tiempo para c/concentración de sustrato (DOPA mg )

Pendientes de c/u de las curvas

Curva del tubo	Pendiente (m)
1	0
2	0,0005
3	0,0007
4	0,0008
5	0,0009
6	0,0012

Sustituir mediante la siguiente ecuación 

C=M/E 

; C= concentración, m= pendiente, E= coeficiente de extinción= 3.7 mM ^-1.

 En este caso, C = V_o cambio de concentración por minuto.

Calcular la V_o para c/u de las concentraciones de  sustrato empleada.

DOPA (PM= 197.2g /mol)

Dopa (mg)	[Dopa] mM	Pendiente m	Velocidad (v)	1/[S]	v/[S]	1/v
0	0	0	0	0	0	0
1	1,034	0,0005	0,00013	0,96	0,00013	7692,3
2	2,069	0,0007	0,00018	0,48	0,000091	5555,5
4	4,139	0,0008	0,00021	0,24	0,000052	4761,9
5	5,174	0,0009	0,00024	0,19	0,000049	4166,6
6	6,209	0,0012	0,00032	0,16	0,000052	3125

Graficar la velocidad (v) en función de la concentración d sustrato [S] en mM. El peso molecular de la DOPA es 197.2g /mol.

Graficar según la ecuación de Lineweaver-Burk (1/V y 1/[S]) y Eadie Hofstee(V y V/[S]).

Como la ecuación de la recta negra (regresión lineal) es:

 y = -0,4137x + 0,0002, y el punto en el que esta recta intercepta al eje V es el punto de la a V _max entonces

Vmax= 0.0002

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

El tubo 1 sirve de referencia;  al no agregar sustrato no es posible la formación del complejo enzima-sustrato,  por lo que no hay forma de que la enzima reaccione. Es por esto que no se registra ninguna velocidad de reacción, ya que la enzima no pudo realizar su función.

Mientras que en el resto de los tubos, al contener diferentes cantidades de sustrato (DOPA) presentan diferentes velocidades. Siendo el incremento de la velocidad de la reacción proporcional a la concentración de sustrato, es decir, entre más sustrato se agrega a la reacción más rápida es esta.
Pero el incremento en la velocidad es hasta cierto punto, cuando la concentración de sustrato llega a un límite. Este limite está marcado por la cantidad de enzima presente en la reacción, ya que la cantidad de enzima en la disolución es la misma, y llega un punto en que la cantidad de sustrato es mayor que la de enzima, por lo tanto no hay suficiente enzima que forme el complejo enzima-sustrato con todo el sustrato presente en la disolución. Es por esto que la reacción alcanza una velocidad máxima y después se vuelve constante. 

CONCLUSIÓN

Se considera que el valor obtenido de Km (0.4137) es pequeño, por lo tanto la afinidad de la enzima Polifenol Oxidasa con el sustrato DOPA  es alta. Y la Vmax de la reacción es de 0.0002.

Bibliografía:


-

http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm

-

Depto. de Biología Molecular.Manual de Prácticas. Biología Molecular de la Célula 1 2010. México. UNAM